荧光定量PCR的原理和计算方法

荧光定量PCR是一种利用荧光探针检测DNA扩增过程中产物数量的技术，它可以用来测定基因表达量或者DNA拷贝数。荧光探针是一段能够特异性地结合到目标DNA序列上的单链DNA，它带有一个荧光发射分子和一个荧光猝灭分子。当探针没有结合到目标DNA上时，两个荧光分子相互靠近，发射分子的荧光会被猝灭分子吸收，所以不会发出荧光信号。当探针结合到目标DNA上时，由于DNA聚合酶的延伸作用，探针会被切断，发射分子和猝灭分子就会分离，这时发射分子就会发出荧光信号。因此，荧光信号的强度就反映了目标DNA的数量。

荧光定量PCR中有一个重要的参数叫做Ct值，它表示达到阈值荧光强度时的循环次数。Ct值越小，说明目标DNA的初始数量越多；Ct值越大，说明目标DNA的初始数量越少。Ct值可以用来计算目标DNA的相对或绝对数量。

如果要计算目标DNA的相对数量，就需要选取一个内参基因作为对照。内参基因是一种在不同样品中表达量稳定不变的基因，它可以用来校正样品之间的差异。计算方法是先求出每个样品中目标基因和内参基因的Ct值之差，即△Ct=Ct（目标基因）-Ct（内参基因），然后比较不同样品之间△Ct值之差，即△△Ct=△Ct（样品）-△Ct（对照），最后用2(-△△Ct)来表示目标基因在不同样品中的相对表达量。

如果要计算目标DNA的绝对数量，就需要制备一个含有已知拷贝数的标准品，并与未知样品一起进行荧光定量PCR。通过绘制标准品中拷贝数（对数）与Ct值之间的线性关系式，即y=-kx+b，其中y为Ct值，x为拷贝数（对数），k为斜率，b为截距，就可以得到一个标准曲线。然后根据未知样品的Ct值代入方程求解，就可以得到未知样品中目标DNA的拷贝数。

荧光定量PCR中还有一个重要的参数叫做扩增效率，它表示每次循环扩增后产物数量相对于上一次循环扩增后产物数量的倍数。扩增效率越高，说明扩增反应越有效；扩增效率越低，说明扩增反应越低效。扩增效率可以用公式E=10(-1/k)-1来计算，其中k为标准曲线的斜率。理想情况下，扩增效率应该接近100%，即每次循环扩增后产物数量增加一倍，此时标准曲线的斜率应该接近-3.32。如果扩增效率低于90%或高于110%，则说明扩增反应存在问题，可能是由于引物或探针的设计不合理、反应体系的优化不足、模板DNA的质量或量不适宜等原因导致的。此时，需要重新设计或优化实验条件，以提高扩增效率。

荧光定量PCR是一种高灵敏度、高准确度、高通量的分子生物学技术，它可以用来研究基因表达调控、基因突变、基因拷贝数变异等多种生物学问题。掌握荧光定量PCR的原理和计算方法，可以帮助我们更好地进行实验设计和数据分析。